우리가 분석하고자 하는 시료 내 아미노산은 다양한 형태로 존재할 수 있습니다. 아미노산의 아미노기와 카복시기가 탈수 축합 반응을 통해 결합된 형태로 존재할 수도 있으며, 아미노산이 개별로 유리된 형태로도 존재할 수 있습니다.

아미노산 분석기를 통해 분석하기 위해선 아미노산은 개별로 유리된 상태로 존재해야 합니다. 따라서 시료 내 존재하는 아미노산의 형태에 따라서 개별로 다른 시료 전처리 과정이 적용돼야 합니다.

 아미노산이 펩타이드 결합으로 강하게 묶여있다면, 그만큼 강한 분해 반응을 유도해 분해해야 합니다. 대표적으로 6M 염산 용액과 110 도씨 조건에서  24시간 동안 가수분해 반응을 진행하여 결합을 풀고 아미노산을 유리시킵니다. 하지만 이 방법은 가혹한 조건이기 때문에 산과 열에 비교적 안정적인 단백질 생성성 아미노산(Proteinogenic Amino Acids)과 일부 아미노산을 제외한 나머지 아미노산들은 파괴됩니다.
반대로 이미 개별 유리된 형태로 존재한다면 컬럼에 오염원으로 작용할 수 있는 몇 가지 물질들만 제거하면 됩니다. 염산 가수분해를 이용하는 것보다 비교적 덜 가혹하기 때문에, 다양한 아미노산을 높은 회수율로 분석할 수 있게 됩니다.

 

 구성 아미노산 분석 혹은 Total Amino Acids Analysis라고 불리는 분석은 시료 내 존재하는 전체 아미노산 조성을 확인하기 위한 분석입니다. 이를 위해 산 가수분해 과정을 진행하게 되며 산과 열에 안정적인 일부 단백질 생성성 아미노산을 제외한 나머지 아미노산은 대부분 파괴되지만, 여전히 우리가 주로 관심있는 단백질 생성성 아미노산은 높은 회수율로 분석할 수 있습니다.

기본적인 단백질 산 가수분해는 6 M 염산과 섭씨 110도 조건 하에 24시간 동안 가수분해가 진행되지만, 이 방법은 시스테인, 시스틴 및 메티오닌같이 분자 구조에 황을 포함하는 황 함유 아미노산에 대해 높은 회수율을 얻기 어렵습니다. 이는  가수분해 과정 중 유입될 수 있는 산소 등에 의해 시스테인, 시스틴 및 메티오닌이 산화되기 때문입니다.

이러한 점을 고려해, 황 함유 아미노산을 높은 정확도로 정량하기 위해선 시료의 가수분해 전 시료 산화 과정을 진행하는 산화 단백질 산 가수분해가 권장됩니다. 이 방법은 과의산(Performic Acid)를 이용해 시료 내 존재하는 황 함유 아미노산을 모두 산화시킵니다. 산화된 단백질은 반응 중단 후 다시 산 가수분해를 진행합니다.

트립토판(Trp; Tryptophan)은 이러한 산성 조건 하에 매우 낮은 회수율을 보입니다. 따라서 트립토판 분석을 위해선 염기 가수분해 방법이 추천됩니다. 이 방법은 4.2 M NaOH 용액을 이용해 단백질 시료를 가수분해합니다. 이 방법은 트립토판의 높은 회수율을 보이지만 반대로 이 외 나머지 아미노산들은 대부분 파괴됩니다.

 

분석자는 시료 내 아미노산의 존재 형태와 분석하고자 하는 아미노산의 종류에 맞게 적합한 전처리 과정을 적용해야합니다. 단백질성 시료 내 아미노산 정성 및 정량을 위한 가수분해 전처리 방법은 다양한 공정서가 존재합니다. 대표적으로 독일 농업 분석 및 연구 기관 협회(VDLUFA)의 VDLUFA 4.11.1 Amino Acids, AOAC의 AOAC Official Method 994.12 FEED and Regulation (EC) No.152/2009, 유럽 약전(Europoean Pharmacopeia)의 EP 5.0 2.2.56 AMINO ACID ANALYSIS 등의 국제적인 공정서가 있으며 국내에서도 식품의약품안전처 11-1471057-000554-01 건 강기능식품공전 시험법 해설서 3. 단백질 및 아미노산류  등의 공정서가 존재합니다.

 본 가이드는 아미노산 분석을 위한 다양한 국제적 공정서에서 제시하는 가수분해 방법을 종합해 Sykam 자동 아미노산 분석기에 적합한 형태로 수정된 방법입니다. 언급된 바 사용자는 필요시 전처리 방법을 수정해 최적화하는 것이 권장되며 이러한 최적화 후에는 여러가지 교차 검증을 통해 해당 전처리 방법이 적합한 방법인지를 확인해야 합니다.

예를 들어 시료 량과 형태에 따라서 염산의 부피와 농도를 조절해야 하며, 시료가 매우 치밀한 조직인 경우 가수분해 시간을 24시간에서 48, 72 시간으로 조절해가며 회수율을 비교해야할 수도 있습니다.

보다 자세한 내용은 첨부된 시료 전처리 방법을 참고해주시면 감사하겠습니다.